霉毒目前发现20多种AFs

黄曲霉毒素是重组二氢呋喃香豆素的衍生物，是漆酶一类主要由黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉等产生的降解接分结构解析高毒性的次级代谢产物，具有很强的黄曲致癌、致畸和致突变性。霉毒目前发现20多种AFs，分对其中AFB₁、析及AFB₂、产物AFG₁、重组AFG₂为天然毒素，漆酶其他毒素主要由这4种衍生得到，降解接分结构解析已经鉴定得到10多种常见的黄曲AFs结构。其中，霉毒AFB是分对自然界发生的最常见的、毒性最强的析及化学致癌物，被国际肿瘤研究机构划定为Ⅰ级致癌物质，并且未规定安全剂量。目前，对AFs的脱除方法有物理脱除（物理吸附、挤压膨化、辐射处理、微波、等离子体降解等）、化学脱除（臭氧、氨气熏蒸、生物碱、乳酸等）及生物脱除（生物吸附、生物降解等）等方法，前2种方法存在效果不稳定、营养成分损失较大以及难以规模化生产等缺点，而生物脱除法由于过程温和、无营养物质大量流失及本身和降解生成物不会对人畜造成危害等优点受到学者的广泛关注并展开了诸多研究。

漆酶（ECI.10.3.2）是一种含铜的氧化还原酶，属蓝多铜氧化酶家族，广泛分布于自然界的昆虫、高等植物、真菌（担子菌、子囊菌和半知菌中较多）和细菌中。漆酶具有广泛的作用底物，能催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类及其他一些杂环类化合物发生氧化生成水而不产生有害的过氧化氢和活性氧等中间产物。基于此绿色催化特性，漆酶在工业废水处理、纺织染料漂白、纸浆木质素去除、土壤和水的生物修复等环境生态领域有非常广泛的应用，在生物燃料电池、生物传感器、制药等方面的经济价值也得到飞速扩展和提升。关于漆酶对AFB₁降解的研究却甚少，且主要集中在降解率的测算上，可达到55%～87.34/%，然而对生成的代谢物结构的认识并不明确。

随着漆酶分子生物学研究的不断深入，近年来一些真菌漆酶的晶体结构相继被解析，为进一步揭示真菌漆酶的催化机制提供结构基础。然而晶体的获得较为复杂，在某些已知漆酶晶体结构的基础上同源模建可以最大程度上获得理想的目的蛋白三维结构，而分子对接技术可以将获得的三维结构分子逐一放在靶标分子的活性位点处，通过模拟小分子配体与生物大分子受体相互作用，预测其结合模式和亲和力。分子对接是探索真菌漆酶酶促降解AFB₁规律和机制的重要手段，对于预测漆酶降解AFB₁效果有重要的意义，而通过实验制备理论预测效果好的改性漆酶将进一步明晰其催化和降解机制。本研究通过分子对接模拟漆酶与AFB，的结合模式并用实际降解实验验证，利用超高效液相色谱-飞行时间串联质谱分析降解产物结构，进一步丰富AFs解毒机理等相关理论，为漆酶降解AFB₁的可行性提供一定的参考。

一、材料与方法

1、材料与试剂

本实验所用产重组漆酶LAC3的酿酒酵母菌株由Dr、ThierryTron's实验室赠送。

三氯甲烷（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯），美国MerdaTechnologyInc公司；AFB，百灵威科技有限公司。

2、仪器与设备

CR22N高速冷冻离心机，日本Himac有限公司；ZWY-200D智诚恒温振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司；HPLC-TripleQ-LC-MS，美国Agilent公司；UPLC-Triple-TOF-MS，美国Waters公司。

3、方法

（1）栓菌漆酶的同源模建

漆酶的目的基因序列通过Uniprot数据库进一步核实，对应的ID为Q6TH77。通过BLAST选择了蛋白数据库PDB中ID为3KW7的漆酶作为模板（氨基酸序列相似性均大于65%），采用MOEv2014.0901软件进行同源模建。在pH7和温度300K条件下利用LigX优化蛋白质的质子化状态和氢原子的取向。首先，将目标序列与模板序列比对，并构建10个独立的中间模型。这些不同的同源模型是不同环候选物和侧链旋转异构体的排列选择的结果。根据GB/VI的打分函数得分最高的被选为最终的模型，使用AMBER12/EHT高压力场进一步能量最小化。

（2）AFs三维结构绘制

用ChemBioDraw2014软件绘制AFB1二维结构图，并通过软件MOEv2014.0901中的EnergyMinimize模块进行能量优化，转换成三维结构。

（3）漆酶与AFB1分子对接

应用软件MOEv2014.0901中的Dock模块，预测AFs和同源模建蛋白漆酶的结合能力。在正式对接之前，选择AMBER12:EHT力场以及R-field隐式溶剂模型。对接流程采用柔性的inducedfit模式，受体结合口袋氨基酸的侧链可根据配体构象进行优化调整，约束侧链转动的权重设置为10。AFs的结合模式首先通过LondondG打分函数进行排序，前30个构象通过进一步力场优化和GBVI/WSAdG方法进行再次评价。采用最佳结合构象模型将配体对接到漆酶的活性位点，根据对接分数、氢键作用和关键氨基酸位点分析对接结果。

（4）AFs标准溶液的制备

分别准确称量1mg的AFB₁标准品，溶解于1mL色谱级甲醇中，配制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液，并进行梯度稀释，配制成不同质量浓度的标准工作液用于降解实验和标准曲线的绘制，-20℃避光保存，待用。

（5）菌株活化及发酵液制备

菌株活化培养基（S-Gal平板）:酵母氮源（YNB，无氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸缓冲液50mmo/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤盐酸盐80mg/L，硫酸铜100μmol/L，愈创木酚0.02%，琼脂15g/L。

漆酶发酵培养基（S-Gal）:酵母氮源（YNB，无氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸缓冲液50mmol/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤盐酸盐80mg/L，硫酸铜100μumol/L。

将菌株转接到S-Gal平板上，28℃恒温培养2～3d，进行活化。将产漆酶的酿酒酵母菌株接种到装有S-Gal培养基的锥形瓶中，置于30℃、160r/min摇床培养4d，进行液体发酵培养。在8000r/min条件下离心30min沉淀菌体，上清液即为漆酶粗酶液，并根据LiuYingli等的方法进行漆酶纯化。

（6）漆酶活力检测

根据吕春鹤等提供的方法并进行改进测定漆酶活力。在30℃、420nm波长下连续监测2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）的氧化速率，在石英比色皿中分别加入pH4.0的0.04mol/LBritton-Robison缓冲液和0.5mmol/L的ABTS溶液，漆酶1min氧化1μmol底物定义为1个活力单位。

（7）漆酶与AFs作用的降解条件

孵育时间对AFs降解率的影响:将酶活力为3U的漆酶与10μL0.1mg/mL的AFB₁标准溶液涡旋振荡混匀，置于30℃、200r/min分别孵育12、24、36、48h和60h。对照组为加入同等体积的pH5.7的0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其他条件相同。

孵育温度对AFs降解率的影响:将酶活力为3U的漆酶与10μL0.1mg/mL的AFB₁标准溶液涡旋振荡混匀，分别置于25、30、35、40℃和45℃温度下，200r/min孵育12h。对照组为加入同等体积的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其他条件相同。

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